雀斑北京哪家医院好 http://baidianfeng.39.net/bdfby/yqyy/引言
“三抬四翻六坐七滚八爬九扶立周会走。”这是一句中国养儿家庭都熟知的民间俗语。这句俗语顾名思义，是指新出生的宝宝三个月会抬头，四个月会翻身，六个月能坐着，七个月会打滚，八个月会爬，九个月能扶东西站立，满一周岁会走。这些在事实情况上虽会有些偏差，但是宝宝们在大运动的进程上基本还是差不多的。每一个宝宝的出生都承载着一个家庭的希望，孩子在每一阶段大运动能力的提升都会使得父母们倍感幸福。但是先天型佩梅病患儿及其家庭却从孩子出世那一刻起，开始了漫长又痛苦的生活，这些孩子终其一生未能获得任何运动能力，只得躺于病床等待家人的照料直至生命的尽头。
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什么是佩梅病？
1)佩梅病（Pelizaeu-MerzbacherDesease,PMD）概述
年，Pelizaeus率先报道了有5例男性患儿的家系，临床主要表现为眼球震颤、四肢麻痹、共济失调、发育迟缓等。年，Merzbacher再次对Pelizaeus所报道的家系进行研究，结果发现，此病具有X连锁隐性遗传特征，且在脑组织活检中发现白质髓鞘缺失，因此将此病命名为Pelizaeu-Merzbacher病，中文翻译为“佩梅病”（PMD）[1]。
距离的年后，佩梅病基因被发现定位于X染色体上的PLP1基因，从此，作为最具代表性的脑白质髓鞘发育落后的脑白质病，有越来越多的佩梅病患者得到确诊。在国内小儿神经领域医院小儿神经科，近10年来已有超过例佩梅病患者得到确诊，用这个领域的专家王静敏教授的话说，佩梅病属于罕见病中的“常见病”[1]。
对患者的基因测序已经证实，PMD的发病机制主要是PLP1基因发生重复突变（duplication）或错义突变（pointmutation）。其重复突变致病约70%，而错义突变约为25%。PLP1蛋白是中枢神经系统中髓鞘蛋白的主要成分，而髓鞘是包裹在神经细胞轴突外面的一层膜，其作用是绝缘，防止神经电冲动从一个神经元轴突外溢到另一神经元轴突。髓鞘由施旺细胞和髓鞘细胞即少突胶质细胞（Oligodendrocyte）膜组成。少突胶质细胞的PLP1基因突变会引起神经髓鞘合成障碍以及正常髓鞘形成缺陷，进而导致佩梅病的发生。
图1少突胶质细胞膜包裹神经轴突形成髓鞘[2]
医院儿科佩梅病的遗传学诊断始于医院儿科同仁的临床病例收集以及年香港Tony先生的鼎力帮助。当时MLPA进行PLP1重复突变的检测还是非常先进的技术，目前仍然为临床诊断佩梅病的首选检测方法，自此开启了我国佩梅病的临床与遗传学研究。自年开始，复旦大学张锋教授、张玲博士等人辛苦付出，共同合作完成49例PLP1重复突变的拷贝数变异与结构异常研究，当时是国际上单中心最大样本量的实验，阐明PLP1重复突变的特点与临床关系。
2)佩梅病的临床表现与临床分型
佩梅病是严重的致死、致残性神经遗传病，患者寿命均较短，严重者仅能存活至几岁，甚至生后即死亡。佩梅病根据临床表现可以分为先天型、经典型与中间型共三型。其中先天型（connatal）患者临床症状严重，出生时发病，表现为钟摆状眼震、肌张力低下、吞咽困难、喘鸣，部分患儿可有癫痫发作。多数于儿童期死亡，少数存活时间较长，但一般不超过30岁。经典型佩梅病也是该病中常见的一种，多于生后数月内发病，最迟不超过5岁。早期表现有眼球震颤、肌张力低下。10岁前运动功能可缓慢进步，可获得上肢随意运动和行走能力，之后逐渐倒退，患者多在30～70岁死亡。中间型（transitional）的临床表现介于先天型和经典型之间。
虽然诱因是同一种基因异常，但是不同临床分型的佩梅病病人的个体差异很大，其疾病发生发展的机制尚不清楚，这也是目前医学上对于PMD的治疗仍然束手无策的原因，至今没有针对PMD有效的治疗药物及方案。想要研究佩梅病的致病机制以及治疗药物，就需要有更好的研究佩梅病的病理学工具。
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什么是细胞病理学？
现代医学之父WilliamOsler先生有一句名言：YourpracticeofmedicineisasgoodasisyourknowledgeandunderstandingofPathology（病理学）。那么什么是病理学呢？病理学是研究人体疾病发生的原因、发生机制、发展规律以及疾病过程中机体的形态结构、功能代谢变化和病变转归的一门基础医学科学。由此可见，病理学被视为是连接基础生命科学与临床医学之间的“桥梁“。
图2WilliamOsler先生名言
年，德国病理学家Virchow根据对大量尸检材料的显微镜改变，提出了细胞病理学的理论，他认为细胞的改变和细胞的功能是一切疾病的基础，并指出了形态学改变与疾病过程和临床表现之间的关系。由此可见，细胞病理学是病理学研究的基础。但是目前细胞病理学在临床的应用基本限于病理学组织切片的观察。其发展的限制因素十分明显：1、应用传统的显微镜观察组织切片，其分辨率十分有限。2、目前样品只能针对固定细胞（死细胞）。3、由于前两项的限制，无法获得活细胞内分子层面的信息。也正是由于以上原因，显微成像在疾病研究中的应用十分受限。
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超分辨显微镜的发展与应用
年诺贝尔化学奖被授予EricBetzig，StefanW.Hell和WilliamE.Moerner3位科学家，以表彰他们在超分辨率荧光显微成像技术方面的重大贡献。近年来，超分辨率荧光显微成像已经成为生物成像中最流行的技术。但是依赖超分辨率荧光成像解决的科学问题还十分有限。其原因主要有以下几个方面：1、成像分辨率的提升是以光子数的增加为代价：超分辨率显微成像光*性和光损伤大，活细胞成像困难。2、活细胞超分辨率显微成像速度很慢，不能捕捉快速的生物反应。3、超分辨率显微镜往往需要特殊的荧光标记，实验步骤繁琐，难以进入普通生物学实验室研究中。在之前，更是从未有过超分辨率成像用于临床研究的先例。
年，北大分子医学研究所陈良怡教授和*小帅博士等人自主研发了超灵敏海森结构光超分辨率显微镜（Hessian-SIM）[3]。这款超分辨率显微镜兼具了硬件创新与算法创新，能够大幅度拓展其在活细胞上的应用，在文章发表后的两年间，已经成为细胞生物学研究的重要工具。
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佩梅病的超分辨病理学研究
有了一个方便使用的超分辨率成像利器后，我医院小儿神经科专家王静敏研究员合作，希望能够更清晰地揭示髓鞘化低下性脑白质营养不良（HLD）这一类疾病背后的机制。研究团队医院小儿神经科的佩梅病患者群中，选取了若干种具有不同临床分型的PLP1错义突变，利用超分辨成像来观察正常和疾病细胞内亚细胞器的形态结构变化并研究不同突变PLP1蛋白在细胞内被运输的差异。
通过在人类少突胶质细胞系MO3.13中表达内质网的指示蛋白mCherry-Sec61β（红色）以及野生型（WT）PLP1或者8种不同突变的PLP1蛋白（绿色），我们发现疾病细胞可以被分为三种表型。比如，PLP1CG细胞中呈现与WT类似的内质网结构，该突变PLP1蛋白定位与正常蛋白十分类似，存在于伪足结构与小囊泡中，而MO3.13细胞的伪足结构与该细胞髓鞘的形成相关[2]。进一步研究发现，该种细胞中PLP1能够被正确的分选到囊泡中，但是这些囊泡在转运、锚定到细胞质膜下以及与细胞膜融合的过程存在缺陷。PLP1GA细胞则很多表现为无伪足结构，突变PLP1蛋白不聚集于细胞膜并且部分滞留于内质网结构中，该类型细胞中很大一部分PLP1蛋白被转运出内质网和高尔基体，但是被错误分选到溶酶体中。最后，在PLP1C96G细胞中，突变PLP1蛋白完全与内质网共定位，并无囊泡状或伪足结构，细胞内的内质网呈扭曲形态，与正常细胞区别很大。
图3几种典型PLP1突变蛋白的定位及内质网形态
接下来，我们分别利用Hessian-SIM（海森-结构光显微镜）和SD-SIM（超高分辨率转盘显微镜）两种超分辨成像手段，对正常与疾病细胞PLP1蛋白在不同亚细胞结构的定位比例进行了分析。我们认为，突变PLP1蛋白与内质网共定位的细胞比例越高，则细胞表型越严重。分析结果令我们十分振奋，细胞表型的分类可以完美预测病人的临床分型！
图4细胞表型与PMD临床分型的对应关系
既然PLP1错义突变在细胞水平上的表型与病人整体临床表型密切相关，那我们就可以尝试在细胞水平上筛选能够缓解细胞表型的药物，从而推广至临床。有一些结果表明，高胆固醇（Cholesterol）饮食可以显著改善轻微重复突变型PMD小鼠的运动功能[4]。因此，我们尝试用胆固醇处理了不同突变的疾病细胞，结果并不完全与前人一致：我们发现胆固醇可以改善最严重的几种错义突变的细胞表型，反而对中等和轻微的错义突变表型没有影响。这个结果表明，与之前认为PLP1蛋白与胆固醇只在高尔基体发生相互作用不同，内质网上PLP1与胆固醇相互作用，参与了PLP1的出内质网过程。这也暗示了该疾病可能的药物干扰靶点。此外，我们还找到另外一种药物，姜*素（Curcumin）也可以显著改善PLP1突变的严重细胞表型，使得严重表型向中间型转换，但是它的作用与胆固醇并不一样。这个结果解释了之前应用姜*素作用在MSD突变的PMD小鼠并延长其生存周期的实验的机制[5]，并验证了细胞水平的药物筛选实验可以扩展到在体实验中。
图5胆固醇（Cholesterol）与姜*素（Curcumin）对细胞表型的改善作用
有意思的是，美国凯斯西储大学PaulJ.Tesar研究组于年7月在Nature在线发表文章，证明在生殖细胞中利用CRISPR-Cas9技术抑制plp1基因或者在出生后的小鼠中利用基于寡核苷酸ASO技术抑制plp1基因，能够缓解PMD小鼠模型中佩梅病的主要症状，并恢复其髓鞘功能以延长动物寿命[6]。科学家们认为该研究工作将为佩梅病的治疗提供可能的治疗方案，同时也为其他的髓鞘相关疾病提供了参考数据。但是，通过基于可控基因操纵的方法（寡核苷酸ASO）也许在小鼠上适用，在灵长类动物以至于病人上是否适用且有无副作用完全未知，对于不同分型的佩梅病病人能否起作用也尚不清楚；相较之下，我们筛选出的姜*素具有可靠的安全性，其作为一种可以通过血脑屏障的成熟药物，现已被用于多种临床疾病的治疗。NIH网站上对姜*素在不同疾病上的临床测试已经高达于个，但是目前并没有其应用于PMD的先例。因此，姜*素有望通过“老药新用”的形式进入临床测试。目前，全世界范围内PMD的临床测试项目只有5个：其中一个被撤回，两个正在招募患者，余下两个全为干细胞移植治疗方案。众所周知，干细胞移植治疗无论是基础理论还是临床实践都处于初期阶段，不具备大规模投入临床的条件。所以，对PMD药物的开发以及“老药新用”的研究策略将会成为攻克该病的重中之重。
图6PMD临床测试的检索结果
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展望
通过对PMD错义突变的超分辨病理学研究，我们将病人来源的不同PLP1错义突变致病机制总结如下表。此工作为佩梅病的精准医疗提供了依据，也为长期遭受病痛折磨的患者及家庭带来了希望。“找到细胞水平的疾病诊断标志物，解析发病机制，为预后评估及药物靶点的精准筛选提供依据，快速将基础科研的成果转化为对病人有意义的治疗方案”，这也是我们提出全新活细胞超分辨率病理学概念的初衷。对疾病超分辨病理学的研究将为临床医生提供其他方法无法观察到的病理信息，该方法也将成为医疗中无法替代的精细、动态、可视化工具，正如灯塔刺破黎明前的黑暗，将真正照亮复杂疾病的内在机制，从而找到对症诊疗方法。
图7不同突变PLP1蛋白运输示意图
目前，该项研究已被ScienceBulletin在线发表。文章第一作者为北京大学分子医学研究所郑晓璐博士，通讯作者由北京大学分子医学研究所研究员陈良医院儿科研究员王静敏共享。
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